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[WpProQuiz 175]

B. problematicus es muy resistente al compuesto xenobiótico toxicina (tx). Aunque los niveles de resistencia están influenciados por las condiciones de cultivo, la incubación previa durante al menos 10 minutos con concentraciones muy bajas (no tóxicas) de tx aumenta considerablemente la resistencia (a concentraciones mayores y tóxicas) en todas las condiciones de cultivo.
Adicionalmente, y dependiendo de la incubación previa con tx, cultivos transferidos a placas de LB (medio rico) muestran resistencia a 20 µg/ml o 100 µg/ml (tras pre-incubación con tx).
Tres mutaciones (mut1, mut2, mut3) obtenidas con diferentes transposones (tn1-3) impiden la supervivencia de B. problematicus en placas con más de 1 µg/ml de tx. En cada caso, la ORF afectada (gen1-3, codifican para Prot1-3) fue clonada en un vector de sobre-expresión compatible y reintroducida en el triple mutante. La sobre-expresión conjunta de los genes 1 y 3 (pero no de 1+2 o de 2+3) es capaz de conferir resistencia a altos niveles de tx en el triple mutante.
El escrutinio para la identificación de mutaciones espontáneas que aumenten los niveles de
resistencia a tx se llevó a cabo en placas con 50 µg/ml de tx. Las dos primeras colonias en crecer (A, B) fueron seleccionadas y, una vez confirmado el fenotipo de aumento de la resistencia, se obtuvieron cultivos líquidos con y sin tx, y éstos se sembraron en placas de Petri con 50, 70, 100, o 150 µg/ml de tx. Los cultivos mutA mostraron el mismo nivel de resistencia en ambas condiciones (hasta 70 µg/ml), mientras que los cultivos mutB mostraron resistencia a 50 µg/ml (- tx) y a 100 µg/ml (+ tx).
Una mutagénesis química y la subsiguiente búsqueda de mutantes más sensibles a tx, produjo como resultado un clon (mutC) que no era capaz de sobrevivir a más de 1 µg/ml de tx. La mutación correspondiente fue localizada en el genoma de B. problematicus, un fragmento de 3 kb que contenía la mutación y sus regiones adyacentes fue clonado en un vector de alto número de copias de B. problematicus y se comprobó que provocaba una disminución en los niveles de resistencia a tx, tanto en la estirpe silvestre como en las estirpes mutA o mutB.
La única mutación en cis en el grupo A, B, C corresponde a mutB.
La adición de concentraciones muy bajas (no tóxicas) de tx en una estirpe silvestre donde lacZ se expresa a partir del promotor del gen2 (P2-lacZ) resulta en: a) un incremento de alrededor de 100 veces en los transcritos de los genes 1 y 3, y b) un incremento de unas 3 veces en los transcritos de lacZ. Sin embargo, la adición de tx en los fondos genéticos mut2 y mutC no produce aumento de los niveles basales de ninguno de estos transcritos, tal como sí vemos en la estirpe silvestre.
[WpProQuiz 176]

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